冻干皮内注射用卡介苗制造及检定规程

本品系卡介菌经培育后冻干制成。用于预防结核病。

1　菌种

1.1　制造卡介苗的菌种，应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。严禁使用通过动物的菌种制造卡介苗。

1.2　如果采用次代种子批，单批收获培养物的总代数不得超过12代（包括在马铃薯培养基上培育的代数与在液体苏通培养基上的代数）。

1.3　菌种检定

新收到的菌种或新制备种子批应进行下列检定。

1.3.1　培养特性

卡介菌在苏通培养基上发育良好。培育温度在37～39℃之间。抗酸染色应为抗酸杆菌。在苏通马铃薯培养基上发育的卡介菌应是干皱成团略呈浅黄色。在牛胆汁马铃薯培养基上为浅灰色粘膏状菌苔。在鸡蛋培养基上有突起的皱型和扩散型两类菌落，且带浅黄色。在苏通培养基上卡介菌应浮于表面，为多皱微带黄色的菌膜。

1.3.2毒力试验

用结素试验（PPD　100IU）阴性，体重300～400g的同性健康豚鼠4只，各腹腔注射1ml菌液（5mg/ml），每周称体重，4～5周后解剖检查，大网膜上可出现脓疱，肠系膜淋巴结及脾可能肿大，肝及其他脏器应无肉眼可见的病变。

1.3.3　毒力试验

用结素试验（PPD　100IU）阴性，体重300～400g的同性健康豚鼠6只，于肌内侧皮下各注射1ml菌液（10mg/ml），注射前称体重，注射后每周观察1次注射部位及局部淋巴结的变化。每2周称体重1次。6周时解剖3只，满3个月将另3只豚鼠解剂，检查各脏器应无肉眼可见的结核病变。若有可疑病灶时，应作涂片和组织切片检查，并采取部分病灶磨碎，加少量生理盐水混匀，皮下注射2只豚鼠。若证明系结核病变，该菌种即应废弃。试验经过详细记录备查。若未满3个月试验豚鼠因其他病患死亡应解剖检查，依上法处理。若死亡2只以上应重试。

1.3.4免疫力试验

用原代种子批以1/100人份的剂量免疫豚鼠，以10³～10⁴强毒人型结核分枝杆菌感染，免疫组与对照组动物的病变指数及脾脏毒菌分离数的对数值经统计学处理，应有显著差异。如无条件，可送中国药品生物制品检定所进行。

1.4　菌种保存

冻干菌种保存于2～8℃。

2　菌苗制造

2.1　卡介苗制造室必须与其他生物制品部门及实验室分开。所需用具如高压锅、冰箱及玻璃器皿等，均须单独设置并专用。卡介苗制造、包装及保存过程均须避光。

卡介苗制造的工作人员及经常进入卡介苗制造室的人员，必须身体健康，经X线检查无结核病，且以后每年经X线检查1～2次，可疑者暂不在卡介苗制造室工作，其检查记录必须保存备查。

2.2制造用培养基

生产用培养基不得含有能使人产生毒性或变态反应的物质。培养基所用的原料应符合《中国生物制品主要原材料试行标准》规定。

2.3　菌种传代与培养

冻干菌种在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基以及液体苏通培养基上每传一次为一代。马铃薯培养基上培育的菌种放冰箱保存不超过2个月。用于生产菌苗的培养物的总代数不超过12代。

2.4　原液制造

2.4.1　收集

培养瓶应逐瓶检查，若有污染、湿膜、混浊等情况应废弃。收集菌膜压干，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨。加入适量无致敏原保护液稀释成一定浓度的原液。

2.4.2　稀释

用中国药品生物制品检定所发给的冻干卡介苗参考比浊标准，以分光光度法或其他适宜方法测定原液浓度，用保护液将原液稀释成1.0mg/ml。

2.4.3　纯菌试验

用于制造卡介苗的培养物、原液、以及稀释后的菌苗均应按《生物制品无菌试验规程》抽样做纯菌试验。

2.5　菌苗分批

用同一代菌种同时制造的菌苗为1批，稀释为数瓶者，按瓶分亚批。

2.6　分装

分装过程中勿使苗混合均匀。每10人份卡介苗应为0.5±0.1mg。

3　冻干

菌苗原液分装后应立即进行冻干。干燥完毕后立即进行真空封口。亦可充氮封口。

4　成品检定

4.1　物理化学检查

冻干卡介苗应为白色疏松体或粉末状。加入稀释液后，应于3分钟内完全溶解成均匀悬液。残余水分不应超过3%。包装前应每支安瓿检查真空，不合格的安瓿应废弃。

4.2　鉴别试验

每批菌苗须做涂片检查，抗酸染色应是抗酸杆菌。

4.3　纯菌试验

每亚批菌苗抽样按《生物制品无菌试验规程》进行。

4.4　活菌计数

同一代菌种制造的各批冻干卡介苗应抽1批做干前活菌计数。同一批菌种制造的各亚批菌苗均应做干后活菌计数，抽安瓿5支稀释混合。冻干菌苗活菌数应在100万/mg以上。可与热稳定性试验同时进行。

4.5　热稳定性试验

取冻干后菌苗放置37℃28天进行加速失活试验，测定活菌数，与4℃保存的同一批菌苗同时进行比较，计算降低的百分离。加温放置制品的活菌数应不少于冷藏菌苗的2%，但不得低于20万/mg。此试验可与参考菌苗同时进行（参考菌苗加入试验的目的为检查培养基的质量）。每一机柜冻干菌勒应抽样进行此项试验。

4.6　安全试验

同一代菌种生产的各批冻干卡介苗应抽1个亚批做安全试验。用结素试验（PPd　10IU）阴性，体重300～400g的同性健康豚鼠6只。每只皮下注射相当于50人份的冻干皮内注射用卡介苗，每2周称重一次，观察6周后，解剖检查每只动物，若肝、脾、肺等脏器无结核病变，该批菌苗即可发出使用。若有可疑病灶时，应按1.3.3项处理。

5　保存与效期

保存于2～8℃暗处。自首次活菌计数结束之日起效期为1年。